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技术专栏

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概述:流式细胞术(FACS)是一项快速检测分析单个粒子多物理特性的技术,通常指细胞通过激光束时在液流中的特性,即粒子的大小,密度或是内部结构,以及相对的荧光强度。通过光电系统记录细胞的散射光信号和荧光信号可得知细胞特性。一、基本原理二、FACS仪器特性FACSCalibur双激光四色FACSAria II双激光八色三、FACS样品准备流式细胞仪分析和分选细胞时,有些问题的出现与仪器没有关系,而与样本制备如样本浓度、缓冲液(PBS)、细胞条件、活性、自发荧光及试剂选择有关。-细胞处理:胰酶(消化贴壁细胞);FBS胎牛血清培养细胞,中和胰酶;PBS用于细胞样品的清洗和重悬,维持细胞基本的PH平衡稳态。-全血处理:淋巴细胞分离液-组织处理...

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一、研究背景细胞因子(Cytokines,CKS)是一类多肽及蛋白的总称,包括白细胞介素和干扰素,集落刺激因子等,参与各种免疫细胞的生长、分化和功能发挥。细胞因子是细胞间普遍存在的信使,起局部或系统调节作用,细胞因子多数是可诱导性的,在各种刺激因素作用下,多种细胞快速合成并分泌细胞因子。正常情况下,细胞因子表达和分泌受机体严格的调控,在病理状态下,细胞因子会出现异常性表达,表现为细胞因子及其受体的缺陷、细胞因子表达过高,以及可溶性细胞因子受体的水平增加等。通过检测细胞因子的变化,可以发现或指导疾病的治疗,例如风湿关节炎的滑膜液中可发现IL-1、IL-6、IL-8水平明显高于正常人,而这些细胞因子均可促进炎症过...

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一、细胞凋亡检测细胞凋亡背景:为程序性细胞死亡,起因可能因为外界环境、生长发育等因素而导致自然死亡现象。当细胞发生apoptosis时,会发生细胞膜PS由胞内外翻至细胞外、粒线体膜电位改变、Caspase活化、DNA fragmentation,一连串的反应使细胞裂解形成凋亡小体,被巨噬细胞识别并清除。1、Annexin V binding assay 破解细胞膜PS外翻凋亡细胞在早期Phosphatidyl-serine ( PS )会由细胞膜内外翻至膜外,利用Annexin V检测能让您作为最快速方便的apoptosis指标。以Annexin V-FITC标示外翻的PS,再合并以PI进行死亡细胞的染色,以区分三种细胞。凋亡细胞可被Annexin V-FITC染成绿色,但对PI拒染;已死亡或Apoptosis后期的细...

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BD™Cytometric Bead Array (CBA)技术利用流式细胞术和不同的微球,同时分析样本中多种可溶性成分的流式检测方法。•多重分析:BD CBA技术支持多达30蛋白的同时检测•节约样本:只需要25至50μl的样本量•灵敏度高:pg级•广泛应用:免疫球蛋白,趋化因子,生长因子以及磷酸化的细胞传导蛋白等。一、CBA 原理:一系列荧光强度不同的微球包被有特异性捕获抗体,与待测样本孵育后,形成三明治复合物。二、CBA的精确性检测•Intra-Assay:三种不同浓度的样本分别重复10次•Inter-Assay:三种不同浓度的样本分别在四个不同的实验室检测三、CBA分析软件-FCAP 3 0CBA分析软件-FCAP 3 0结果四、CBA Ki...

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流式实验操作流程BD Accuri C6-Annexin V方法检测细胞凋亡BD Accuri C6-PI检测细胞周期BD FACSCalibur-AnnexinV检测细胞凋亡BD FACSDiva 流式软件-AnnexinV 方法检测细胞凋亡CBA操作手册

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G蛋白偶联受体(GPCR)、整合素、离子通道蛋白……几乎所有的膜蛋白都是研究热点。当然,那是因为它们太重要了。作为细胞结构与功能的关键成分,它们担当了很多重要角色。同时,这些蛋白也是重要的药物靶点。然而,膜蛋白研究的道路上却布满了荆棘。无论是抽提、表达,还是后续的结晶、三维结构分析,都让研究人员伤透脑筋。膜蛋白通过许多疏水氨基酸残基锚定在膜结构里面,很难溶解在水性缓冲液系统中。为了制备膜蛋白样品,传统的方法是使用去污剂和表面活性剂增溶。但去污剂处理会使膜蛋白丧失其天然结构,因而又妨碍了膜蛋白的功能研究。 根据其明显的疏水性特点,人们常用去污剂+机械处理的操作方法获取膜蛋白,用于增溶的去污剂有...

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丁香园上一篇好文章!除了抗体原因,转膜恐怕是western blot成败的最关键因素。蛋白来源:RAW264 7 总蛋白蛋白名称(可保密):一些转录因子蛋白分子量:40~70 KDWB用膜类型、孔径:0 45 NC转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒流400 mA转膜时间:60~90 minPS 其实吧,以我的经验来看,除非目的蛋白特别小,或者特别大,不然转膜时间真的不是那么重要,曾经因为失误,转了15 min就拆下来了,但从丽春红染色来看,跟平常实验也没有太大的区别。蛋白来源:内皮细胞 总蛋白蛋白名称(可保密):occludin & AKT蛋白分子量:65 KD & 56 KDWB用膜类型、孔径:0 45 PVDF转膜方式(恒压、恒流):湿转 恒压 100 V转膜时间:60...

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有关IHC和ICC的详细疑难解答提示和技术没有染色一抗和二抗不匹使用针对一抗来源的种属产生的二抗(例如,一抗来源于兔,使用抗兔的二抗)。确保一抗和二抗的同 种型匹配(例如,IgY 和 IgG)。结合到目标蛋白的一抗不足提高抗体的工作浓度,在 4 ℃ 孵育更长时间(例如,过夜孵育)。抗体可能不适于蛋白以天然状态( 3D 形式)呈现的 IHC查看抗体数据表,确认抗体是否经过 IHC 验证,并确认验证的 IHC 类型(福尔马林 PFA 固定、冰冻切片等)。使用天然(未变性)WB 检测抗体,确保抗体未被破坏。一抗 二抗 放大试剂盒可能由于储存不当、稀释不当或反复冻融而失活使用阳性对照来确保一抗 二抗的有效性(参见第 4 部...

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